概述
 

　　為了在不同的組織中導航，遷移細胞必須平衡持續(xù)的自我推進運動與規(guī)避障礙的適應性行為。我們確定了類免疫細胞躲避障礙的曲率傳感機制。具體來說，我們提出，在質膜向內彎曲的區(qū)域中，曲率敏感的 BAR 結構域蛋白 Snx33 會抑制遷移細胞前進邊緣的肌動蛋白聚合。這種機制的遺傳擾動降低了細胞逃避障礙的能力，同時細胞在無障礙環(huán)境中遷移得更快、更持久。我們的結果展示了細胞如何讀取其表面形貌并利用肌動蛋白和質膜生物物理學來解釋其環(huán)境，從而使它們能夠適應性地決定是否應該前進或轉身。根據我們的發(fā)現，我們提出 BAR 結構域蛋白的天然多樣性可能允許細胞調整其曲率傳感機制以匹配其環(huán)境中的形狀特征。
 

　　介紹
 

　　細胞遷移驅動許多發(fā)育、生理和病理過程。雖然推進機制已廣為人知，但仍不清楚細胞如何引導其運動以導航復雜和動態(tài)的環(huán)境1并繞過組織內的障礙2 , 3。這些適應性行為對于快速且動態(tài)的細胞類型尤其重要，例如免疫細胞和傳播腫瘤細胞?；诩拥鞍椎耐黄鸷推鹋葜g的切換已被證明有助于細胞發(fā)育中的控制4，但細胞通常僅表現出富含肌動蛋白的突起，例如片狀偽足和褶邊。它們需要足夠長的壽命，以便細胞能夠探索并持續(xù)地在周圍環(huán)境中移動，同時又足夠“不穩(wěn)定”，以便它們在遇到障礙時能夠適應并改變方向5 , 6。
 

　　在遷移過程中，細胞的最外層邊界(質膜)因微環(huán)境的變化而變形。然而，目前尚不清楚膜曲率是否編碼細胞用來選擇其遷移路徑的信息7、8，或者膜形貌是否只是作用在細胞表面的力的副作用。許多遷移細胞確實表達多種曲率感應蛋白，它們可以直接與質膜和下面的肌動蛋白細胞骨架相互作用9。特別是，BAR 結構域蛋白家族可以促進膜曲率傳感。這些蛋白質形成新月形膜結合二聚體，可以感知和產生曲率9、10、11，并且已知通過幾個輔助結構域與肌動蛋白細胞骨架的調節(jié)因子(例如 Arp2/3 復合物、福爾明或 Rho GTPases)相互作用9、12。事實上，表面形貌的變化會誘導一些胞質 BAR 結構域蛋白募集到高度正(向內)曲率的區(qū)域13，并且可以觸發(fā)肌動蛋白結構和內吞熱點的形成14、15。在這里，我們發(fā)現曲率感應 BAR 結構域蛋白 Snx33 抑制肌動蛋白聚合并重新排列 WAVE2 的定位，以限制前緣的持續(xù)存在并引導遷移。通過這種機制，Snx33 允許細胞自適應地決定是否應該向前移動或轉身離開。
 

　　結果
 

　　Snx33 優(yōu)先被排除在遷移細胞前緣的向外彎曲的膜區(qū)域之外
 

　　在分化過程中，類免疫HL-60細胞的基因表達發(fā)生顯著變化，啟動快速遷移，并獲得復雜的膜形貌，類似于體內骨髓中發(fā)生的情況16(補充圖1a  )。終末分化的運動細胞(dHL-60 細胞)在前緣顯示出富含肌動蛋白的板狀偽足和膜皺褶(圖 1a、b)。為了更詳細地分析膜形貌，我們使用掃描電子顯微鏡(SEM)來觀察天然固定細胞膜的超微結構細節(jié)，并使用偏振全內反射熒光顯微鏡(p-TIRFM)來探測活細胞中的膜曲率動力學。我們觀察到彎曲的膜圖案，如通過 SEM 在上部質膜中看到的那樣(圖 1c)，這是非常動態(tài)的，如通過 p-TIRFM 在基底質膜中觀察到的那樣(圖 1d，補充圖 1b-d和補充視頻 1 )。
 

　　圖 1：片狀偽足和曲率敏感蛋白 Snx33 的曲率圖案。
 

　　a遷移細胞的前緣具有復雜的曲率模式。箭頭表示細胞運動的方向。線條描繪了復雜的 3D 環(huán)境。b延時明場成像顯示免疫樣分化的 HL-60 細胞的遷移。c野生型細胞的掃描電子顯微鏡 (SEM) 圖像，前緣放大。n  = 175。d p-TIRFM 成像的延時 p 偏振顯示前沿的動態(tài)膜波。e分化(遷移)和未分化(非遷移)HL-60 細胞之間上調(橙色)和下調(藍色)BAR 結構域基因。f細胞中 z 平面上部(靠近細胞頂部)和下部(近表面平面)的熒光標記 Snx33 (eGFP-Snx33) 和膜標記( CAAX-mcherry)。g通過共焦顯微鏡獲得的不同高度的熒光標記的 Snx33 和膜標記的皮爾遜相關系數。n  = 10。誤差線表示平均值的標準誤差。h使用 AlphaFold 多聚體(綠色)建模的 Snx33 PX-BAR 結構域的結構與不完整晶體結構(PDB ID：4AKV；灰色)的比較。i在 PX-BAR 質心(綠色，平均曲率PX-BAR  = 16 μm -1)和隨機脂質磷酸位置(黃色)采樣的平均曲率 (H) 的概率直方圖。顯示了平滑分布的核密度估計。平均值表示為垂直虛線。j具有 PX-BAR 域的屈曲膜的粗粒度模擬快照的俯視圖和側視圖。顯示了蛋白質主鏈珠(綠色)、磷酸鹽珠(黃色球體)和脂質尾部(灰色棒)。為了清楚起見，省略了水和離子。顯示了俯視圖和側視圖。指示各個幀的時間點。k , l使用點陣光片顯微鏡觀察遷移細胞的橫截面 ( xz )，放大膜皺邊 ( k )和片狀足 ( l ) 上的 eGFP-Snx33 和 CAAX-mcherry 進行可視化。n  = 6。m Snx33 相對于質膜開和關褶皺的平均z位置的量化( p TopMembrane  = 0.01635，t  = -3.5524，df = 5，配對，兩側)。n  = 6 個單元，其數據是從雙色 3D 電影中獲得的。每個點代表 1 個單元格的平均值。比例尺 = 10 μm。p < 0.05 (*)。
 

　　這些彎曲的膜圖案可能構成曲率敏感蛋白的結合位點，例如來自 BAR 結構域家族的蛋白。為了從這個大家族中識別出能夠感知凹進障礙并因此與細胞遷移過程中的適應性行為相關的候選者，我們測量了 HL-60 分化為遷移狀態(tài)(即曲率較差(原始細胞為原始細胞))之前和之后的表達譜。均勻圓形)與曲率豐富的狀態(tài)(補充圖 1a)。BAR結構域蛋白Snx33的表達在此分化過程中增加了16倍(圖 1e)。我們在熒光標記(eGFP-Snx33)后通過共聚焦顯微鏡對其亞細胞定位進行成像，發(fā)現Snx33在整個膜皺褶處富集(圖 1f，g)，即dHL-60細胞前緣的高度彎曲結構。基于其蛋白質家族內的相似性，與 BAR 亞組9的許多其他 BAR 結構域蛋白質相比，Snx33 預計會結合淺曲率。Snx33(PX-BAR)的膜結合結構域在凸面上包含一個帶正電的斑塊，這強烈表明該表面上存在向內曲率依賴性膜結合(補充圖2a-d  )。為了更詳細地評估其曲率傳感特性，我們對具有質膜衍生脂質成分的屈曲膜上的 PX-BAR 結構域(圖1h-j)進行了長的粗粒度分子動力學(MD)模擬(表 S1；詳細信息請參見方法)。這種計算分析已被廣泛用于表征多種蛋白質17、18(包括其他 BAR 結構域19 )的曲率傳感特性。在 30 µs 長的模擬過程中，Snx33 的 PX-BAR 結構域仍然與膜緊密結合，并表現出對具有向內局部曲率的膜區(qū)域的強烈偏好(圖 1i，j，補充圖 2e  ， f  )。Snx33 將質膜與賴氨酸和精氨酸等堿性殘基表面結合，介導靜電相互作用(補充圖 2a –d、3a、b、4a–g，詳細信息請參閱 補充討論)，這對于質膜結合很常見20 . 為了進一步測試 Snx33 在細胞中的曲率敏感性，我們通過晶格光片顯微鏡對其亞細胞定位進行了成像，并且支持我們的 MD 模擬，我們發(fā)現 Snx33 被排除在褶邊和片狀偽足邊緣之外，這兩種結構都具有高度負性(向外)曲率(圖 1k-m，補充圖 5和補充視頻 2，有關詳細信息，請參閱方法)。為了證實 Snx33 的排除，我們將其定位與 IRSp53(也稱為 BAIAP2)(一種典型的向外曲率結合蛋白)的定位進行了比較21。如前所述，在中性粒細胞樣細胞中，IRSp53 積聚在前進纖維和回縮纖維22、23的，即已知的向外彎曲結構(補充圖 6a-c和補充視頻 3)?？偠灾?，我們表明，含有 BAR 結構域的蛋白質 Snx33 對具有向內局部曲率的膜區(qū)域有強烈的偏好，并且在前緣富集，但被排除在向外彎曲的膜結構之外。
 

　　Snx33 控制前沿生長并調節(jié)質膜張力
 

　　為了研究 Snx33 在適應性遷移中的作用，我們使用 CRISPR/Cas9 基因組編輯生成了 Snx33 敲除 (Snx33-/-) 細胞系(補充圖 7a、  b)。免疫樣細胞中的推進取決于細胞前緣肌動蛋白的活性聚合24、25。鑒于細胞形狀反映了運動驅動的富含肌動蛋白的突起26的變化，我們對選定的細胞形態(tài)參數(即細胞鋪展、細胞偏心度和前沿特征)進行了定量和公正的比較。由于免疫細胞在短時間內改變其形態(tài)，我們對延時電影進行平均以捕捉它們的動態(tài)。為此，我們在 ilastik 27中訓練并使用基于機器學習的算法來分析全內反射熒光顯微鏡 (TIRFM) 成像的細胞影像(詳細信息請參閱方法)。Snx33-/-細胞擴散到更大范圍，并表現出更細長的形態(tài)和更大的前緣(圖 2a-f，補充圖 8a-e和補充視頻 4和5)，與基質的粘附無關(補充圖 8f-i)。此外，可以通過表達熒光標記的Snx33來挽救擴散面積和前緣面積的增加，證明觀察到的表型的特異性(補充圖 8b，c)?？偠灾@些結果表明 Snx33-/- 細胞在遷移過程中具有更穩(wěn)定的前緣。
 

　　圖 2：Snx33 敲除細胞由于肌動蛋白聚合增加而表現出細胞和前緣形態(tài)的改變。
 

　　野生型和 Snx33-/- 細胞的 TIRFM 圖像。b細胞擴散面積(p  = 1.505e-7，Mann–Whitney- U檢驗，兩側)和c運動過程中野生型和 Snx33-/- 細胞之間的偏心率不同(p  = 0.004989，Mann–Whitney- U -測試，雙面)。d野生型和 Snx33-/- 細胞的前緣分割。時間范圍(5 秒)采用顏色編碼。e前沿面積(p  = 1.634e-5，Mann–Whitney- U檢驗，兩側)和f長度(p  = 0.2111，Mann–Whitney- U檢驗，兩側)。n  = 82(重量)，n  = 78(Snx33-/-)。g靜態(tài)系繩拉動實驗示意圖。h 來自 3 個獨立實驗的 wt ( n  = 24)、Snx33-/- ( n  = 26) 和 Snx33-/- 與過表達 eGFP-Snx33 ( n = 25)的平均靜態(tài)系留力( p wt 與 Snx33-/-  = 7.883e-6，t = −5.0144，df = 47.376；p wt 與 Snx33-/- + eGFP-Snx33  = 0.2141，t  = −1.2601，df = 45.515；p Snx33-/- 與 Snx33-/- + eGFP-Snx33  = 0.2141，t  = -1.2601，df = 45.515，兩側)。i通過流式細胞術定量固定 wt 和 Snx33-/- dHL-60 細胞中鬼筆環(huán)肽熒光強度的中值。來自 3 個獨立實驗的數據(p t00  = 0.184，Mann–Whitney- U檢驗，雙邊；p t01  = 0.0373，t  = −4.26，df = 2.375，雙邊；p t30  = 0.1298，t  = -1.9728 ，df = 3.5035，兩側)。j全長 Snx33 及其結構域和兩個 Snx33 截斷(ΔPXBAR 和 PXBAR)的示意圖。免疫共沉淀實驗中比較 Snx33-/- 與 Snx33-/- + GFP-Snx33、Snx33-/- + GFP-Snx33ΔPXBAR 和 Snx33-/- + GFP-Snx33PXBAR 的火山圖。富集命中(limma p值 ≤  0.01，倍數變化 ≥  50%)顯示為綠色，其余為灰色。比例尺 = 10 μm。p  < 0.001 (***), p  < 0.01 (**), p < 0.05 (*)。箱線圖：下鉸鏈和上鉸鏈對應于第 25 個和第 75 個百分位數。上部須線從鉸鏈延伸至最大值，但不超過 1.5*IQR。下部須線從鉸鏈延伸至最小值，但不低于鉸鏈的 1.5*IQR。胡須之外的數據：黑點。黑線：中位數。黑點：意思。
 

　　已知持續(xù)遷移過程中前緣生長和細胞擴散增加會增加質膜張力28 , 29。為了測試由 Snx33 損失引起的更穩(wěn)定的前緣是否會導致更高的膜張力，我們使用原子力光譜法通過靜態(tài)系鏈拉力在前緣測量了它，其中質膜系鏈保持恒定長度直到斷裂(圖 2g )。我們發(fā)現Snx33-/- dHL-60細胞中的靜態(tài)系繩力顯著增加(從61.58到75.25 pN，圖 2h)，這對應于表觀膜張力幾乎增加了50%(從177.87到265.62 μN/ m；有關詳細信息，請參閱方法)。此外，膜張力的增加可以通過穩(wěn)定表達熒光標記的Snx33來挽救，排除Snx33獨立功能作為該表型的起源(圖 2h)。值得注意的是，Snx33-GFP在野生型背景上的過度表達并沒有降低膜張力，這表明功能的獲得不足以改變前緣或其對膜力學的影響(補充圖9a  )。最后，這些表型不是分化缺陷的結果，因為中性粒細胞分化標記物 CD11b 在 Snx33-/- 細胞中不受干擾，也不是 CRISPR/Cas9 技術生成細胞系引起的潛在脫靶效應的結果(補充圖 9b  ， C)?？偠灾@些結果證實 Snx33-/- 細胞具有更穩(wěn)定的前沿，顯示出持久遷移所需的所有特征。
 

　　Snx33 調節(jié)肌動蛋白聚合
 

　　我們的研究結果表明，曲率感應蛋白 Snx33 負向調節(jié)肌動蛋白聚合，從而限制前緣尺寸。因此，我們通過流式細胞儀添加趨化劑(fMLP)后通過鬼筆環(huán)肽染色定量絲狀肌動蛋白(F-肌動蛋白)的量，并觀察到與野生細胞相比，Snx33-/-細胞中F-肌動蛋白的總量顯著增加-型對應物(圖 2i)。這表明 Snx33 對肌動蛋白聚合發(fā)揮抑制作用，特別是在刺激后的最初爆發(fā)期間。但是 Snx33 是如何抑制肌動蛋白聚合的呢？一些 BAR 結構域蛋白通過直接結合肌動蛋白或通過招募激活肌動蛋白相關蛋白 2/3 (Arp2/3) 復合物的成核促進因子 (NPF) 來重塑肌動蛋白9 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34。為了了解 Snx33 如何抑制肌動蛋白聚合，我們在敲除背景中共免疫沉淀全長 GFP-Snx33 及其結合伴侶，然后進行質譜分析。由于BAR結構域蛋白之間普遍存在分子內自抑制相互作用，因此我們還對含有或缺失PX-BAR結構域但跨越全長蛋白的Snx33的兩個截短物進行了共免疫沉淀(圖2j  )。Arp2/3復合體的幾個成員以及加帽蛋白的兩個亞基與Snx33共免疫沉淀(limma p值 ≤0.01  ，倍數變化≥50%)(圖2j)。特別是，我們在全長 GFP-Snx33 或其截短物中發(fā)現了 ARPC2、ARPC4-TTLL3、ACTR2、ACTR3、CAPZA1 和 CAPZB1 的正倍數變化，表明 Snx33 與 Arp2/3 復合物和加帽蛋白結合。Arp2/3 復合體是肌動蛋白成核劑，負責中性粒細胞前緣的片狀偽足和皺褶形成35，而加帽蛋白通過與肌動蛋白絲結合來終止肌動蛋白絲的生長，并通過 Arp2/3 復合體增強其分支36，37、38、39。_ _ _ _ 有趣的是，我們可以觀察到，與全長蛋白相比，一些 Arp2/3 組件和加帽蛋白亞基的任一結構域都顯著富集(補充圖 10a)，這表明 Snx33 的不同結構域以不同的親和力結合它們，可能 是因為自抑制相互作用可能會遮擋結合位點或影響膜結合，如其他 BAR 結構域蛋白的報道40 , 41 , 42?？傊琒nx33 可能通過調節(jié) Arp2/3 復合物和/或加帽蛋白來負向調節(jié)肌動蛋白聚合。
 

　　Snx33 影響 WAVE2 定位和褶邊形態(tài)
 

　　WAVE2 是中性粒細胞中 Arp2/3 復合體上游已知的肌動蛋白 NPF 24、35。因此，為了進一步表征 Snx33-/- 細胞的前緣，我們在 TIRFM 遷移過程中對 WAVE2 復合體 (Hem-1) 的一個組成部分(以下稱為 WAVE2)進行了成像(圖 3a 和補充 視頻6 和7 )。WAVE2 因其在細胞遷移過程中定位于基底膜上的波而得名24。為了產生這樣的模式，WAVE2 波在其尾跡中沉積一種抑制劑，暫時抑制 WAVE2 募集24。有趣的是，聚合肌動蛋白是這種抑制反饋的關鍵組成部分，但調節(jié) WAVE2 與膜結合并決定其斑塊形態(tài)的因素仍然知之甚少43。因此，我們使用基于機器學習的分割來量化 WAVE2 模式特征。引人注目的是，Snx33-/- 細胞的 WAVE2 面積及其質膜斑塊的大小增加了 40%(圖 3b-d)。為了確定這是由于 WAVE2 成分表達水平的差異還是由于膜結合增加所致，我們進行了 RNAseq。與對照細胞相比，我們觀察到 Snx33-/- 細胞的表達沒有差異或有非常微小的差異(補充圖 10b)，這表明 Snx33 影響 WAVE2 復合物的定位而不是其表達。這是特別有趣的，因為迄今為止，僅報道了非常劇烈的 WAVE2 補丁表型，這導致遷移能力嚴重破壞44 , 45。接下來，我們試圖測試 WAVE2 斑塊形態(tài)變化與前沿形態(tài)的功能相關性。為此，我們從SEM圖像中量化了有效褶邊波長，并觀察到與野生型細胞相比，Snx33-/-細胞的褶邊排列明顯不那么緊密(圖3e，f，補充圖8j， 補充圖 8j ) .  11a ). 最后，為了確定有效皺邊波長的增加是否僅僅是 Snx33-/- 細胞膜張力增加的結果，我們對 PLD2 敲低 (KD) 細胞進行了 SEM，該細胞也顯示膜張力增加44。值得注意的是，與 Nonsense 細胞相比，PLD2 KD 細胞的有效褶皺波長沒有差異(補充圖 11b、c)。這些發(fā)現將 Snx33 確定為膜形狀與調節(jié)膜形狀的肌動蛋白聚合因子之間的聯系。
 

　　圖 3：Snx33 敲除細胞中 WAVE2 圖案寬度和褶皺波長增加。
 

　　野生型和 Snx33-/- 細胞的 TIRFM 圖像顯示了 WAVE2 的分布，WAVE2 是中性粒細胞中 Arp2/3 復合物上游的肌動蛋白成核促進因子。b前緣 WAVE2 斑塊占據的總面積在 Snx33 丟失后增加(p  = 0.000408，Mann–Whitney- U檢驗，兩側)。n  = 82(重量)，n  = 78(Snx33-/-)。c野生型和 Snx33-/- 細胞中動態(tài) WAVE2 斑塊的分割。時間范圍(5 秒)采用顏色編碼。d當 Snx33 丟失時，WAVE2 斑塊的大小會增加(p  = 0.000464，Mann–Whitney- U檢驗，雙面)。n  = 82(重量)，n  = 78(Snx33-/-)。帶有皺褶分割的 SEM 圖像(紅色)顯示了分布第50 個百分位數的野生型和 Snx33-/- 細胞的前緣。f有效褶邊波長隨著 Snx33 的損失而增加(p  = 3.171e-7，Mann–Whitney- U測試，雙面)。n  = 175(重量)，n  = 170(Snx33-/-)。統計：t檢驗或非參數 Mann–Whitney- U檢驗。比例尺 = 10 μm。p  < 0.001 (***)、p  < 0.01 (**)、p  < 0.05 (*)。箱線圖：下鉸鏈和上鉸鏈對應于第 25 個和第 75 個百分位數。上部須線從鉸鏈延伸至最大值，但不超過 1.5*IQR。下部須線從鉸鏈延伸至最小值，但不低于鉸鏈的 1.5*IQR。胡須之外的數據：黑點。黑線：中位數。黑點：意思。
 

　　Snx33 支持曲率相關的物體躲避
 

　　迄今為止，我們的數據表明膜曲率結合蛋白 Snx33 調節(jié)肌動蛋白聚合、前沿形態(tài)和穩(wěn)定性。前緣圖案可以通過減少持久性和促進隨機規(guī)避動作來促進適應性運動。但 Snx33 介導的膜肌動蛋白耦合的特殊形式表明了一種額外的、更直接的效應，其中推進力特別是在細胞路徑中可能存在障礙的情況下減少，即外部壓痕產生增加的分數具有向內彎曲的區(qū)域。因此，Snx33 可以促進細胞轉向，因為碰撞產生的膜變形會局部下調推進力，從而重新定向前緣。為了檢驗這個假設，我們首先將細胞定位在微流體裝置46、47中，它們在其中遷移通過通道并遇到不同尺寸孔形式的障礙物。Snx33-/- dHL60 細胞需要比野生型細胞多幾乎 20% 的時間來導航這些決策點并找到阻力最小的路徑(圖 4a，補充圖 12a、b 和補充 視頻8  )。由于細胞核已被證明可以作為沿著最小阻力路徑的機械引導46，因此我們通過原子力壓痕測量了核剛度，并排除了 Snx33-/- 細胞中核力學受到的影響(補充圖 12c，d) ，與它們保留的讀取孔徑的能力一致(補充圖 12b)。然而，在無決策通道中，Snx33-/-細胞的遷移速度比野生型細胞快80%，包括在通過單個收縮通道期間(圖4b、 補充圖 12e和補充視頻 9)。接下來，我們用均質化學引誘劑量化了 2D 平面基底上的無限制遷移，促進細胞運動，而不需要細胞適應任何障礙(圖 4c，詳細信息請參閱方法 )。與在無決策通道中一樣，Snx33-/-細胞比野生型細胞遷移得更快(圖 4d)。此外，雖然Snx33-/-細胞的運動性更持久，但野生型細胞更傾向于進行大的自發(fā)轉動(圖 4e)。因此，Snx33的缺失似乎使細胞不太容易自發(fā)轉動，并且在繞行物體時效率較低，同時在無決策環(huán)境中表現出更持久的遷移。這些遷移表型與我們在 Snx33-/- 細胞中觀察到的前緣尺寸和質膜張力的增加一致(圖 2d-h))?？傊@些觀察結果表明 Snx33-/- 細胞的推進能力有所提高，但在面臨障礙時缺乏適應能力。
 

　　圖 4：Snx33 通過抑制 WAVE2 復合物來引導單細胞 2D 和 3D 遷移中的細胞運動。
 

　　a細胞中的決策通道通過時間(n wt  = 159，平均值 = 1.67 分鐘；n Snx33-/-  = 9；平均值 = 1.96 分鐘)(p  = 0.02，Mann–Whitney- U -測試，兩側)。b細胞中的收縮通過時間(n wt  = 234，n Snx33-/-  = 158)(p  = 2.2e-16，Mann–Whitney- U-檢驗，兩側)。c wt 和 Snx33-/- 細胞中細胞體隨時間的位移。時間范圍(5 秒)采用顏色編碼。d wt 和 Snx33-/- 細胞的細胞速度(p  = 7.661e-5，Mann–Whitney- U檢驗，兩側)e細胞在遷移過程中轉動的角度分布(p  = 0.0007583，Mann–Whitney- U測試，雙面)。N wt  = 82，n Snx33-/-  = 78。數據來自 3 個獨立的生物重復。f兩個 wt 或 Snx33-/- dHL-60 細胞之間接觸事件的分割。陰影突出顯示接觸持續(xù)時間。g wt (n  = 18) 和 Snx33-/- ( n = 20) dHL-60 細胞中與另一個細胞接觸的細胞周長百分比 (p  = 0.0001704，Mann–Whitney- U檢驗，兩側)。h使用各種技術測量的曲率大小的可視化。i通過 SBEM 成像顯示單個和碰撞的遷移 dHL-60 細胞的橫截面。N single  = 6，n collided  = 6。j單個和碰撞遷移單元前緣絕對曲率值的可視化(來自i)。k直方圖，顯示單個像元和碰撞像元前緣的絕對曲率值分布(n個單個像元 = 6，n 個碰撞像元 = 6)。數據點表示每個單元格的平均值。lxy平面的單個和碰撞的遷移 dHL-60 細胞的膜標記 (CAAX)，通過點陣光片繪制。m單個和碰撞遷移細胞前緣絕對曲率值的可視化(來自l)。n直方圖顯示晶格光片圖像中單個細胞和碰撞細胞前緣的絕對曲率(n個單個 = 5，n個碰撞 = 5)。數據點表示每個單元格的平均值。o帶有熒光標記的 Snx33 和 Hem1 的 wt dHL-60 細胞中細胞與細胞接觸的明場和p TIRFM 成像。箭頭指向細胞與細胞的接觸。n  = 3. q WAVE2 在 wt (n  = 9) 和 Snx33-/- ( n  = 10) dHL-60 細胞中細胞接觸后的倍數變化( p  = 0.01816, t  = -2.5877, df = 18.789, 兩個雙面)。比例尺 = 10 μm。p  < 0.001 (***)、p  < 0.01 (**)、p  < 0.05 (*)。箱線圖：下鉸鏈和上鉸鏈對應于第 25 個和第 75 個百分位數。上部須線從鉸鏈延伸至最大值，但不超過 1.5*IQR。下部須線從鉸鏈延伸至最小值，但不低于鉸鏈的 1.5*IQR。胡須之外的數據：黑點。黑線：中位數。黑點：意思。
 

　　為了進一步了解 Snx33 缺陷細胞的物體逃避反應，我們設計了一種還原性測定法來測試接觸運動抑制 (CIL)，這是許多細胞類型(包括 dHL-60s)中的常見現象，其中細胞停止在當它們與另一個細胞或物體24、48接觸時，它們會朝特定方向移動。為了測試 CIL 作為對細胞障礙的反應是否受 Snx33 控制，我們接種了更高密度的 dHL-60 細胞，并通過 TIRFM 在細胞間相互作用的情況下對它們的 2D 遷移進行成像。與野生型細胞相比，Snx33-/-細胞形成更大的細胞-細胞接觸(圖 4f，g)，這與它們在面對惰性障礙時增加的決策時間一致(圖 4a)。我們的計算結果與觀察到的 Snx33 定位(圖 1h-m)表明優(yōu)先結合到向內彎曲的區(qū)域。為了評估細胞之間碰撞時質膜幾何形狀發(fā)生的變化，我們量化了碰撞后自由移動細胞和成對細胞前緣的曲率差異。我們進行了連續(xù)塊面掃描電子顯微鏡(SBEM)，手動分割質膜，并量化了xz平面中碰撞和單細胞前面的自由和接觸區(qū)域的曲率(圖 4h- k  )。此外，為了排除潛在的固定偽影，我們使用膜標記(CAAX)和xy平面上的晶格光片(LLS)成像分析了自由遷移和碰撞活細胞的前緣(圖4l-n和補充 圖13f  ) -我)。在這兩個數據集中，我們觀察到單個細胞和碰撞細胞之間正面的曲率分布發(fā)生變化。雖然單細胞表現出偏向外曲率的更廣泛分布，但接觸表面的特征是以零為中心的更窄分布，這與接觸部位的整體平坦化一致。細胞與細胞的接觸抑制了正曲率和負曲率(補充圖 14a-d)。
 

　　為了進一步剖析 Snx33 在 CIL 中的分子作用，我們同時對活細胞前緣的中性粒細胞 WAVE2 復合物(使用 Hem1)和 Snx33 進行成像。雖然這兩種蛋白質在很大程度上共定位于細胞的大部分部分，但它們在前緣的高度負彎曲邊緣中呈反相關(補充圖 15a、b)。在這里，Snx33水平下降，而WAVE2積累(補充圖 15c，d)，這與Snx33被排除在向外彎曲區(qū)域之外并限制WAVE與這些區(qū)域的結合一致。此外，當細胞碰撞時，Snx33定位于細胞接觸區(qū)域，隨后WAVE2消失并重新定位到質膜的無接觸區(qū)域(圖4o，p)。隨后，細胞通過形成新的前沿而重新極化(圖 4o，p)。為了評估 Snx33-/- 細胞中功能失調的 CIL 反應是否是由于接觸區(qū)域的 WAVE2 抑制受損所致，我們在 Snx33-/- 細胞碰撞前后跟蹤了 WAVE2 定位(補充視頻 10  )。與野生型細胞相比，Snx33-/-細胞確實未能從接觸位點去除WAVE2(圖 4q和補充圖 15e)?？偠灾?，我們展示了曲率感應蛋白 Snx33 在 CIL 期間調節(jié)肌動蛋白聚合中的關鍵作用。具體來說，Snx33 取代了細胞與細胞接觸區(qū)域的 WAVE，從而在與障礙物碰撞時導致細胞向無接觸區(qū)域重新極化。
 

　　討論
 

　　物體逃避不僅是免疫細胞和癌細胞在復雜組織環(huán)境中遷移的關鍵，而且也是胚胎發(fā)生和體內集體遷移的基礎49。結合遺傳擾動、顯微鏡和微流體，我們發(fā)現了免疫樣細胞適應性運動背后的曲率傳感機制。我們發(fā)現，BAR 結構域蛋白 Snx33 可以讀出膜曲率景觀的變化，并反饋給肌動蛋白聚合機制，以調節(jié)遷移細胞前緣的復雜模式。具體來說，Snx33 抑制肌動蛋白聚合并調節(jié) WAVE2(中性粒細胞中主要成核促進因子)的定位。因此，Snx33 限制了前緣的持續(xù)性并降低了遷移方向性。這種促進細胞遷移過程中自發(fā)重新定向的機制補充了豐富表達的 I-BAR 結構域蛋白的機制，其中向外曲率傳感與肌動蛋白聚合的局部激活相結合增強了探索性細胞行為22。雖然很少有其他 BAR 結構域蛋白含有對肌動蛋白聚合具有抑制作用的結構域，但它們可能并不完全冗余。我們設想它們的作用機制將是多種特性的結果，包括曲率敏感性、結合強度、結合伙伴以及存在的其他域。因此，BAR 結構域蛋白成為多功能工具，可以局部激活或抑制肌動蛋白聚合，從而賦予細胞對其前緣的功能控制。
 

　　自發(fā)地重新定向和探索具有動態(tài)突出物的微環(huán)境的能力本身有助于在擁擠的環(huán)境中更有效地導航6,22,44,46,50,51。此外，突出活動的曲率依賴性下調還可以通過引導細胞遠離外部最有可能存在障礙物的方向，更直接地幫助躲避物體。事實上，我們證明 Snx33 是細胞繞過惰性障礙和細胞障礙并從而在復雜的三維環(huán)境中遷移的關鍵。迄今為止，人們對協調 CIL 的分子機制知之甚少。srGAP2 是一種結合向外膜曲率的 BAR 結構域蛋白，顯示在 CIL 52、53、54、55期間誘導突出。我們的研究表明，向內彎曲感應蛋白 Snx33 在抑制 CIL 期間肌動蛋白聚合方面發(fā)揮著關鍵作用。具體來說，我們表明多結構域蛋白 Snx33 定位于細胞與細胞接觸并將 WAVE2 重新分配到自由表面，從而重新定向細胞。這可能以依賴于曲率的方式發(fā)生，因為Snx33優(yōu)先定位于向內彎曲的膜區(qū)域，而WAVE2被限制于前緣23處的向外彎曲的區(qū)域。在細胞與細胞接觸處，我們使用測量曲率值相差一個數量級的兩個數據集來識別曲率分布的明顯變化。具體而言，碰撞時，曲率分布比遷移單細胞的自由前緣的曲率分布更窄，這與碰撞時膜變平一致。Snx33 PX-BAR 二聚體的預期曲率靈敏度對應的曲率高于細胞-細胞碰撞時測量的曲率。然而，值得注意的是，BAR 結構域蛋白具有輔助結構域，可以形成寡聚體以及線性聚集體，以相當低的曲率56、57、58結合膜。此外，我們對細胞的觀察僅限于曲率半徑，其大小高于各自的圖像分辨率極限，并受到可檢測的曲率長度尺度的限制。因此，在未來，探索形成組裝以及輔助結構域的存在/不存在如何允許 BAR 結構域蛋白跨越更大的曲率半徑以響應分子復雜性內膜形狀的更大規(guī)模變化將是很重要的。細胞19 , 59。
 

　　在這里，我們表明 Snx33 對肌動蛋白聚合的調節(jié)對細胞遷移具有重要影響。這與 BAR 結構域蛋白固有的曲率傳感特性以及 CIL 期間細胞間碰撞時觀察到的膜曲率分布變化相結合，表明膜曲率改變直接適應性細胞行為的機制。總之，我們的研究支持了這樣的觀點：細胞利用其膜地形來編碼有關它們遇到的外部環(huán)境的信息。
 

　　鑒于細胞中存在的 BAR 結構域蛋白的多樣性，我們預計這種調節(jié)原理可能用于許多必須對形狀變化做出反應的生物功能，從亞細胞水平(細胞器穩(wěn)態(tài)、膜運輸)，通過單-細胞水平(免疫監(jiān)視、腫瘤傳播)到多細胞水平(原腸胚形成、組織折疊)。
 

　　方法
 

　　細胞培養(yǎng)
 

　　HL-60 細胞在含有 10% 熱滅活 FBS (#10500-064, Gibco) 和 1% 青霉素-鏈霉素 (#15140-122, Gibco) 的 RPMI 1640 培養(yǎng)基中于 37 °C、5% 的加濕培養(yǎng)箱中生長二氧化碳2。通過添加 1.5% DMSO(#D2438，Sigma Aldrich)來分化細胞，并在 5 天后使用。每個獨立區(qū)分的批次被視為生物復制。對于饑餓，將細胞在含有 0.3% 無脂肪酸 BSA(#A7030-10G，Sigma Aldrich)的無 FBS RPMI 1640 培養(yǎng)基中保存 1 小時。為了成像或固定，將 dHL-60 細胞鋪在纖連蛋白包被的(0.01 mg/ml，#356008，Corning)玻璃底培養(yǎng)皿(#627860，Greiner bio-one)上，并在生長培養(yǎng)基中粘附 10 分鐘。接下來，洗滌細胞并用 10 nM fMLP(#F3506-5MG，Sigma Aldrich)刺激。為了降低粘附力，涂層中添加了 5% 摩爾 BSA(#A7030-10G，Sigma Aldrich)。為了生成帶有熒光標記的 Snx33 及其截短物(PXBAR 和 ΔPXBAR)以及 Hem1 和 CAAX 的穩(wěn)定細胞系，如前所述使用慢病毒轉導44。細胞在 EMBL 流式細胞術核心設施的 BD FACS Aria™ Fusion 上進行分選。
 

　　通過 CRISPR/Cas9 產生敲除細胞系
 

　　如前所述，在 HL-60 細胞中進行 CRISPR/Cas9 生成45。簡言之，將靶指導序列克隆至靶Snx33 ，進行60、61(正向：CACCGctgggacgacGGATGCACAG；反向：aaacCTGTGCATCCgtcgtcccagC )。表達 BFP 標記的 Cas9 的細胞在 EMBL 流式細胞術核心設施的BD FACS Aria TM Fusion上的 96 孔板中進行單細胞分選。單細胞克隆通過 Touchdown PCR 62 的基因組 DNA 擴增和測序進行驗證，然后對選定的克隆系進行蛋白質印跡。
 

　　RNA測序
 

　　根據制造商的說明，使用 RNeasy Mini Kit(#74104，Qiagen)純化從 3 個生物重復獲得的總 RNA 樣品，并進行 DNase 消化步驟(#79254，Qiagen)。為了確保高質量，樣品在 Agilent 2100 生物分析儀(Agilent Technologies)上進行分析。RNA 測序是在 EMBL 基因組學核心設施的 Illumina NextSeq 500 平臺(NextSeqHigh-75 SE)上進行的。為了進行序列比對，使用了 hg19 參考基因組。使用 DESeq2 軟件包通過定制 Galaxy 管道進行差異表達分析。RNAseq 數據已存入 BioStudies 的 ArrayExpress 館藏，登錄號為E-MTAB-12436。
 

　　影像學
 

　　活細胞的 TIRFM 圖像是在 Nikon Ti Eclipse 倒置顯微鏡上采集的，配有 CFI Plan Apo Lambda 100x Oil(#MRD01905，尼康)硅膠物鏡和由 NIS-Elements(尼康)控制的 sCMOS 相機。使用自動對焦系統(Perfect Focus，尼康)進行延時成像可減少樣品漂移。
 

　　固定細胞的共焦圖像是在 EMBL 先進光學顯微鏡設施的 Olympus FV3000 倒置顯微鏡上使用 UPLSAPO 60X S(NA 1.3；WD 0.3 mm)硅膠物鏡獲得的。
 

　　使用 40 倍物鏡(#MRD00405，尼康)、SOLA SE II 和 100 W 鹵素燈(尼康)并使用適當的濾光片組，對固定細胞進行落射熒光和明場成像。
 

　　偏振 TIRFM (pTIRFM) 模式是在以前的工作63、64、65、66、67、68的基礎上實施的。為了成像，在用碳花青染料 DiI(#D3911，ThermoFisher Scientific)鋪板前對 dHL-60 細胞進行染色。
 

　　使用適當的濾光片組和 10 × 550 μm 基光束，在 Zeiss Lattice Light Sheet 7(Zeiss，Oberkochen，德國)上進行活細胞的點陣光片成像。
 

　　圖像分析
 

　　對于共焦圖像(圖 1g和補充圖 15b)，基于覆蓋整個重新切片最大強度 z 投影的線掃描，僅考慮包含 mCherry-CAAX 最高 80% 強度的z平面。感興趣的通道 (ChoF1) 用于基于自動 Otsu 分割的掩模生成。定制的 ImageJ 腳本允許我們使用內置的 Coloc2 ImageJ 插件，基于 ChoF1 的掩碼，計算 ChoF1 和 ChoF2 的每個z平面的皮爾遜相關系數 (PCC)。Z切片被分配到 10 個箱，并計算每個箱的平均值以及平均值的標準誤差。
 

　　為了分析 TIRFM 成像的遷移細胞(圖 2b-f、圖 3b-d和圖 4c-e)，細胞掩模(基于 mCherry-CAAX 信號)和 WAVE2 掩模(基于eGFP-Hem1 信號)是使用基于機器學習的 ilastik 軟件(版本 1.3.1b1 和 1.3.3post3)獲取的27。使用 Python 實現的內部構建程序實現了進一步的圖像分析。根據連續(xù)三個幀的質心計算細胞移動的角度。前沿被定義為兩個連續(xù)幀之間的差異，其中每個簇存在至少一個 WAVE2 掩模像素。前緣長度定義為前緣外周的像素數。為了分析細胞-細胞接觸，使用相同的分割策略來分割單個細胞。細胞-細胞接觸被定義為兩個細胞的周界相交。
 

　　對于SEM數據的膜形貌分析(圖 3e，f，補充圖 8j，補充圖 11a-c)，在中值濾波圖像上手動分割帶有褶邊的前緣區(qū)域。接下來，使用Meijering濾波器69在分割區(qū)域內檢測脊。隨后使用自動 Otsu 閾值對脊進行分割，并使用自定義 Python 腳本進行骨架化。每個前緣區(qū)域的骨架化內的像素數量的反轉對應于有效褶皺波長。
 

　　為了分析 SBEM 和晶格光片圖像的膜曲率(圖 4i-n和補充圖 13b-e、g、i)，在前緣(定義為質膜前面的區(qū)域)手動分割質膜。核)或分別使用帶有膜信號的熒光通道上的 Otsu 閾值進行分割，然后進行手動管理。接下來，使用自定義 Python 腳本，通過將圓擬合到具有用戶定義長度(指定半寬的 2 倍 + 1 像素)的窗口，沿著分段膜滑動來量化曲率。為了確定曲率的符號，將基準點手動添加到圖像中以指向細胞內部(補充圖 14a-d)。
 

　　為了根據點陣光片圖像(圖 1m和補充圖 5)分析與膜相關的蛋白質位置，僅在 MIP 中具有可見膜皺褶的細胞包含在分析中。通過 Mejiering 過濾和 Otsu 閾值處理，在 MIP 中對褶邊進行分割。對于用戶定義的 ROI 中的所有像素，提取膜和 Snx33 通道的z線并標準化為其峰值強度。為了解釋不同x – y位置處細胞厚度的變化，通過定位與頂部和底部細胞膜相對應的膜通道中的峰值來對z線進行歸一化(所有檢測到超過 2 個峰值的z線均被排除在外)分析)。然后將歸一化的z線分成對應于底部和頂部細胞膜的兩半，然后通過計算Snx33和膜通道之間的重疊來評估每一半的Snx33共定位。所有顯示低重疊的z線半部均被排除在進一步分析之外。接下來，將對應于一個細胞的所有z線合并并分成褶邊內組和褶邊外組以及頂膜和底膜亞組。為了允許在褶邊內和褶邊外組之間進行無偏比較，調整每組中的z線分布以包含相同頻率的單元厚度。實際上，由于褶邊外組比褶邊內組包含更多的z線，所以對褶邊外組進行隨機二次采樣以重構褶邊內組中的分布。最后，由于單個z線的 SNR不允許準確評估 Snx33 到膜的距離，我們采用 bootstrap 進行平均，其中對每組中的隨機 100 個z線進行平均并重新標準化為其峰值強度。然后測量膜通道和 Snx33 通道中信號首次達到 20% 的位置之間的距離。然后多次重復此過程以生成捕獲原始數據異質性的距離分布。對于每個細胞，提取 4 個亞組中每個亞組的平均值，并對它們進行比較以驗證該方法的穩(wěn)健性。
 

　　基于 PDMS 的設備中的細胞遷移測定
 

　　基于PDMS的微流體裝置的制備如前所述46、70、71。用于遷移 dHL-60 細胞的裝置的決策點通道和收縮通道的高度分別為 2.8 和 3.13 μm。決策通道在兩種排列中具有 2、3、4 和 5 μm 的收縮。具有單個收縮的通道為2μm。為了可視化細胞核和細胞體，在將細胞引入 PDMS 裝置之前添加 Hoechst 33342(#62249，Thermo Fisher Scientific)和 TAMRA(Invitrogen)。使用配備 Lumencor 光源(390 nm、475 nm、542/575 nm)、孵育室和帶有CO 2的加熱臺。使用 ImageJ 分析獲取的數據并手動整理。僅考慮移動穿過整個通道的單個細胞進行分析。所有參數均根據核信號進行量化。
 

　　使用原子力光譜進行系鏈擠出
 

　　通過擠壓質膜系鏈來測量表觀膜張力。為了進行測量，將 Bruker 的 Olympus BioLever ( k  = 60 pN/nm) 安裝在帶有 JPK SPM 軟件 6.1.183 的 CellHesion 200 AFM (Bruker) 上，該軟件集成到 Eclipse Ti 倒置光學顯微鏡 (Nikon) 中。使用熱噪聲方法校準懸臂并涂有 2.5 mg/ml Concanavalin A(#C5275，Sigma Aldrich)。測量之前，用 dPBS 沖洗懸臂。對于系繩測量，將懸臂放置在細胞上方，最好放置在前緣上方。靜態(tài)系繩拉動實驗的測量參數如下：接近速度設置為1μm/s，接觸力設置為100-300pN，接觸時間設置為5-10s，回縮速度設置為10μm/s。拉動 10 μm 的系繩后，懸臂位置保持不變直至斷裂，但不超過 30 秒。在每次實驗重復中，條件的順序都是隨機的。對于每個細胞，至少進行 3 次不同的系鏈測量。
 

　　使用JPK數據處理軟件6.1.183進行數據分析。為了根據系繩力測量來評估膜張力的大小，使用了以下公式44：
 

　　?=?028??2
 

　　(1)
 

　　其中F 0是 AFM 測量的系繩力，B是質膜的彎曲剛度，我們假設它在不同的實驗條件之間保持不變( 基于之前的測量72 , 73為 2.7 × 10 -19 Nm )。
 

　　fMLP 刺激后非貼壁 dHL-60 細胞的 F-肌動蛋白染色
 

　　通過向生長培養(yǎng)基中的10 6 個細胞添加等體積的2x固定緩沖液來饑餓并固定細胞，或用10 nM fMLP刺激并在刺激后0、1和30分鐘固定。固定緩沖液 (1x) 含有 3.7% 多聚甲醛(#28908，Thermo Scientific)、1x 細胞內緩沖液(140 mM KCL、1 mM MgCl 2、2 mM EGTA、20 mM HEPES，pH 7.5)、320 mM 蔗糖 (#S0389-500G ，Sigma Aldrich)和 0.2% BSA(#A7030-10G，Sigma Aldrich)。接下來，通過板離心，用 1x 細胞內緩沖液小心洗滌細胞，并在含有 0.2% Triton X-100(#T8787，Sigma Aldrich)的細胞內緩沖液(1x)中用與 TRITC(#P1951，Sigma Aldrich)偶聯的鬼筆環(huán)肽染色 1 小時)。然后再次用細胞內緩沖液(1x)洗滌細胞。最后，將它們重懸于 1 ml 0.1% BSA、2.5 mM EDTA 的 dPBS 中，并在 EMBL 流式細胞術核心設施中使用 Cytek® Aurora (Cytek) 進行分析。使用 FlowJo 軟件(版本 10.9.0)進一步分析數據并繪制圖表。
 

　　免疫共沉淀
 

　　對于免疫共沉淀，通過病毒轉導和細胞分選將 GFP 標記的 Snx33 及其截短物添加到 Snx33-/- 細胞系中。按照補充有蛋白酶抑制劑(#gtd，Chromotek)的 ChromoTek GFP-Trap Magentic Particles M-270 后，按照細胞質蛋白的建議進行 dHL-60 細胞的收獲和裂解。過夜旋轉后，使用 GFP-nanotrap 珠子從裂解物(全長 Snx33 和兩個截短：PXBAR 和 ΔPXBAR)中沉淀 GFP 標記的蛋白質。在 2xSDS 樣品緩沖液中進行洗脫并提交進行質譜分析。
 

　　蛋白質質譜分析
 

　　樣品制備
 

　　使用二硫蘇糖醇(56 °C，30 分鐘，10 mM，50 mM HEPES，pH 8.5)和 2-氯乙酰胺(室溫，黑暗中，30 分鐘，20 mM，50 mM HEPES，pH 8.5)進行還原和烷基化。根據 SP3 協議制備樣品(https://doi.org/10.15252/msb.20145625、https://doi.org/10.1038/s41596-018-0082-x )。簡而言之，以 1:50 的酶與蛋白質比例添加測序級胰蛋白酶 (Promega)，在 37 °C 下過夜消化。通過收集磁體上的上清液并將其與第二次洗脫合并，在 50 mM HEPES(pH 8.5)中進行肽回收。
 

　　根據制造商的說明，用 TMT16plex 同量異位標記試劑 (ThermoFisher) 標記肽。簡而言之，將 0.8 mg 試劑溶解在 42 µl 乙腈 (100%) 中，加入 8 µl 儲備液，并在室溫下孵育 1 小時。將反應用 5% 羥胺在室溫下猝滅 15 分鐘。使用 OASIS® HLB µElution Plate (Waters) 合并并凈化樣品。
 

　　質譜分析
 

　　UltiMate 3000 RSLC 納米液相色譜系統 (Dionex)，配有捕集柱(μ-Precolumn C18 PepMap 100、5 µm、300 µm 內徑 x 5 mm、100 Å)和分析柱(nanoEase™ M/Z HSS T3 色譜柱)使用 Nanospray Flex™ 離子源在正離子模式下將 75 µm x 250 mm C18、1.8 µm、100 Å，Waters)與 Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™ 質譜儀(Thermo)耦合。以 30 µl/min(0.05% 三氟乙酸水溶液)的恒定流速將肽濃縮到捕獲柱上 4 分鐘。隨后，使用溶劑 A(0.1% 甲酸水溶液、3% DMSO)以 0.3 µl/min 的恒定流速和逐漸增加的溶劑 B(0.1% 甲酸乙腈溶液， 3% DMSO)在 4 分鐘內從 2% 升至 8%，再持續(xù) 104 分鐘從 8% 升至 28%，再用 4 分鐘。從 28% 到 40%，最后 40%–80%，持續(xù) 4 分鐘，然后在 4 分鐘內重新平衡回到 2% B。
 

　　質譜儀參數如下：噴霧電壓2.4 kV，毛細管溫度275 ℃，MS1質量范圍375~1500  m / z，輪廓模式，軌道阱，分辨率120000。最大填充時間50 ms， AGC 目標設定為標準。將 Orbitrap 的分辨率設置為 30000，填充時間為 94 ms，離子限制為 1 × 10 5 ，進行數據相關采集 (DDA )  。應用歸一化碰撞能量 34。MS2 數據是在剖面模式下獲取的。將第一個質量固定為 110  m / z。
 

　　質譜數據分析—Isobarquant
 

　　IsobarQuant 74和 Mascot (v2.2.07) 用于處理獲取的數據。根據包含常見污染物和反向序列的智人蛋白質組數據庫 (UP000005640) 搜索數據。搜索參數中包含以下修飾：脲甲基 (C) 和 TMT10 (K)(固定修飾)、乙?；?蛋白質 N 端)、氧化 (M) 和 TMT10(N 端)(可變修飾)。對于全掃描 (MS1)，設置的質量誤差容限為 10 ppm；對于 MS/MS (MS2) 譜圖，設置的質量誤差容限為 0.02 Da。設置了進一步的參數：胰蛋白酶作為蛋白酶，最多允許兩次遺漏切割：最小肽長度為 7 個氨基酸；蛋白質鑒定至少需要兩種的肽。肽和蛋白質水平的錯誤發(fā)現率設置為 0.01。
 

　　使用 R 編程語言 (ISBN 3-900051-07-0) 分析 IsobarQuant 的原始輸出文件(蛋白質.txt 文件)。僅具有至少兩個肽的蛋白質被包括在分析和定量中。總共 561 種蛋白質通過了質量控制過濾器。使用 limma (PMID: 25605792) 清理原始信號和(signal_sum 列)的批次效應，然后使用 vsn 進行標準化(方差穩(wěn)定標準化 - PMID：12169536)。為了測試蛋白質的差異富集，使用了 limma 包。重復信息作為設計矩陣中的一個因素附加到 limma 的“lmFit”函數的參數中。命中被定義為錯誤發(fā)現率 (fdr) 小于 5% 且倍數變化至少 100% 的蛋白質，以及 fdr 低于 20% 且倍數變化至少 50% 的候選蛋白。質譜蛋白質組學數據已通過 PRIDE 75合作伙伴存儲庫存入 ProteomeXchange 聯盟，數據集標識符為 PXD033666。
 

　　分子動力學模擬
 

　　粗粒度分子動力學模擬
 

　　使用 GROMACS 2021.4 76進行分子動力學模擬，使用粗粒度 Martini2.2 力場77 , 78并對所有蛋白質珠應用既定的縮放程序 (alpha = 0.7) 79 。
 

　　作為結構模型的基礎，使用了 Snx33 膜結合域 (PX-BAR) 的現有晶體結構 (PDB ID: 4AKV)。由于該結構中缺少一些環(huán)，我們使用默認設置的 AlphaFold-multimer 80、81預測了相同的序列，但將循環(huán)次數增加到 6。所得模型與晶體結構非常一致(RMSD：2.3 Å)，并且直接用于模擬。結構模型是粗粒度的，使用“martinize.py”腳本78應用 DSSP 分配的二級結構約束，并使用跨兩個子單元的彈性網絡82 ，其中f c  = 500 kJ/mol −2和截止c  = 1.2 nm 如先前報道的其他擴展 BAR 蛋白的模擬19。對于所有無序線圈區(qū)域，所有彈性鍵均被移除。
 

　　然后將蛋白質置于彎曲膜上，該膜是根據以下程序壓縮平坦膜而產生的。瘋狂的計算脂質組學：用于生成用于分子模擬的定制膜的多功能工具。 J.化學。 理論計算。 11, 2144–2155 (2015)。">使用“insane.py”工具83制備尺寸為70 x 35 x 20 nm 3的平坦對稱雙層。使用通過質譜測定的質膜衍生的脂質組合物作為輸入(表 S1)。將膜溶劑化并添加Na +離子以使系統電荷中性。然后使用最陡下降算法 1000 步將膜能量最小化。
 

　　隨后，使用 Berendsen 恒壓器84和速度重新調節(jié)恒溫器85在 NPT 系綜(半各向同性壓力耦合)中以 20 fs 的時間步長對雙層進行模擬 50 ns 。分別使用 1 ps 和 4 ps 的耦合時間。所有模擬中的溫度均設置為 310 K。采用Verlet鄰居搜索算法更新鄰居列表，長度和更新頻率自動確定。Lennard-Jones 力和庫侖力在r c = 1.1 nm處截止 ，使用 Verlet 位移電位調節(jié)器將電位移至 0 86。
 

　　然后，將側向壓力設置為 10 bar 以生成屈曲膜結構(P x,y  = 10 bar，P z  = 1 bar)。從壓縮軌跡中提取兩種不同曲率的膜，盒子尺寸分別為 58.9 × 29.5 × 25.9 nm 3(多余膜面積 = 25.1 nm 2)和 56.3 × 28.2 × 28.3 nm 3(多余膜面積 = 31.4 nm 2)。
 

　　在這兩個系統中，蛋白質都被放置在彎曲膜上方并重新溶劑化和電荷中和。使用上述設置進行簡單平衡，并以f c  = 1000 kJ mol -1  nm -2維持對蛋白質的位置限制。平衡運行 250 ns。然后使用具有固定x、y尺寸和P z  = 1 bar 的各向異性壓力耦合進行生產模擬。生產模擬進行了 30 µs。使用與上面相同的模擬參數，除了使用耦合時間為 20 ps 87的 Parrinello-Rahman 恒壓器來控制壓力。
 

　　圖像和可視化是使用 VMD(版本 1.9.4)88制作的。使用 MDAnalysis 1.1.1 89、90和 python 3.6進行分析。為了分析彎曲膜上蛋白質的曲率偏好，Bhaskara 等人先前建立了協議。使用了17 (參見：https: //github.com/bio-phys/MemCurv)。通過優(yōu)化最小二乘擬合，每 1 ns 將高度函數h (x,y) 的二維傅里葉展開擬合到膜的磷酸鹽珠上。隨后，從擬合高度函數h ( x , y )的形狀算子導出平均曲率 H 。計算蛋白質質心的x、y位置以及隨機選擇的磷酸鹽珠位置的平均曲率 H，以在每個考慮的幀對背景膜進行采樣。
 

　　掃描電子顯微鏡 (SEM)
 

　　10 nM fMLP 刺激 30 分鐘后，通過直接添加 37 °C 雙倍強度固定劑(0,1 M PHEM 中的 5% GA)將細胞固定在 0,1 M PHEM 緩沖液中的 2.5% GA(#16220，EMS)中 1 :1 至細胞培養(yǎng)基。孵育10分鐘后，用新鮮的單濃度固定劑替換固定劑，并在室溫下進一步固定細胞1小時。固定后，將細胞在0.1M PHEM中洗滌2次，并在0.1M二甲胂酸鹽緩沖液中洗滌2次。接下來，將它們在新鮮制備和過濾的 1% OsO 4 (#19190，EMS) 和 0.8% 亞鐵氰化鉀 (K 4 [Fe(CN) 6 ]*3H 2 O，#4984，Merck)中后固定 2 小時。在 0.1 M 二甲胂酸鹽緩沖液中。后固定后，將細胞在H 2 O中洗滌4次，并置于4°C直至進一步處理。
 

　　接下來，使用 Pelco BioWave 微波爐，用新鮮制備并過濾的 1% 單寧酸(TA，CAS#1401-55-4，EMS)水溶液處理細胞，在 150 W 和 0 W 功率之間交替進行七個 1 分鐘循環(huán)。穩(wěn)定溫度設置為 23 °C，所有步驟均開啟真空。TA 處理后，在工作臺上用H 2 O洗滌細胞 2 次，并在微波爐中用H 2 O 洗滌 2 次，每步 40 秒，功率為 250 W。然后使用與 TA 相同的微波程序，用 1% UA (#77870, Serva) 的 H 2 O溶液處理細胞。在 H 2 O 中洗滌一次并在 25% EtOH 中洗滌兩次后，使用具有步長的微波程序在分級系列乙醇 (25%–50%–75%–90%–100%–100%) 中脫水40 秒和 250 W 功率，穩(wěn)定溫度為 4 °C，無真空。最后，使用具有 6 個微波程序的乙醇 (25%–50%–75%–100%–100%) 溶液梯度系列六甲基二硅氮烷(HMDS，CAS# 999-97-3，Sigma Aldrich)浸潤細胞。每個步驟 1 分鐘，步驟 1、3、4 和 6 的功率為 150 W，步驟 2 和 5 的功率為 0 W。最終 100% HMDS 滲透后，除去所有 HMDS，并讓蓋玻片干燥過夜。將帶有水分指示劑的硅膠(Merck)添加到24孔板的4個空孔(角落)中以除去多余的濕度。
 

　　干燥后，使用碳帶將蓋玻片安裝在鋁棒(Agar Scientific G301F)中，并使用 Q150RS 型 Quorum 濺射鍍膜機在 30 mA 電流下濺鍍一層金，持續(xù) 180 秒。
 

　　成像在 Zeiss Crossbean 540 顯微鏡上進行，使用 5 kV 加速電壓和 700 pA 電子束電流，工作距離為 5 mm。使用二次電子探測器 (SESI) 進行信號檢測，所有圖像均以 28.9 nm/像素的像素大小獲取。
 

　　串行塊面掃描電子顯微鏡 (SBEM)
 

　　在 MatTek 培養(yǎng)皿中進行 10 nM fMLP 刺激 30 分鐘后，通過直接添加 37 °C 雙倍強度固定劑(0.1 M PHEM 中的 5% GA)將細胞固定在 0.1 M PHEM 緩沖液中的 2.5% GA(#16220，EMS)中 1 :1 至細胞培養(yǎng)基。孵育 10 分鐘后，用新鮮的單一強度固定劑替換固定劑，并將細胞在固定劑中于 4 °C 孵育過夜。固定后，將細胞在 0.1 M PHEM 中洗滌 2 次，并在 0.1 M 二甲胂酸鹽緩沖液中洗滌 2 次。接下來，將它們在 1% OsO 4 (#19190, EMS) 和 0.8% 亞鐵氰化鉀(新鮮制備并過濾)中的冰上后固定 1.5 小時(K 4 [Fe(CN) 6 ]*3H 2 O，#4984， Merck)在 0.1 M 二甲胂酸鹽緩沖液中。后固定后，將細胞在H 2 O中洗滌4次，并留在4℃的H 2 O中直至進一步處理(5天)。
 

　　接下來，按以下順序連續(xù)三個步驟對細胞進行染色：1% 硫代碳酰肼(TCH，#21900，EMS)水溶液、2% OsO 4水溶液和 1% UA(#77870，Serva)水溶液。對于所有三個染色步驟，細胞均在 Pelco BioWave 微波爐中處理，每個程序分為 7 步，功率在 100 W 和 0 W 之間交替(從 100 開始)，穩(wěn)定溫度設置為 23 °C，真空開啟所有步驟。在每個染色步驟之間，將細胞在 H 2 O 中洗滌 4 次，在工作臺上洗滌兩次，在微波爐中洗滌兩次(40 秒，250 W 功率，真空關閉)。
 

　　UA染色后，將細胞在H 2 O中洗滌一次，在25% EtOH中洗滌兩次，然后在分級乙醇系列(50%–70%–90%–100%–100%)中進一步在微波中脫水。脫水步驟的微波設置為：時間 40 秒，功率 250 W，真空關閉，穩(wěn)定溫度 4 °C。
 

　　脫水后，將細胞浸潤到乙醇(25%–50%–75%–100%–100%–100% durcupan)中的分級系列 durcupan 樹脂(來自 Sigma 的 Durcupan ACM，#44611-#44614(四種成分))中)，使用微波，每步 3 分鐘，功率 150 W，23 °C 穩(wěn)定溫度和真空循環(huán)。
 

　　最后，將細胞放在少量新鮮樹脂上(覆蓋 MatTek 培養(yǎng)皿的中心)并放置約 1-2 小時以蒸發(fā)殘留溶劑和氣泡。在聚合之前，除去大部分樹脂(僅留下足以覆蓋中心的樹脂)。將一滴 durcupan 添加到 18 × 18 mm 蓋玻片中(以避免滯留氣泡)，然后將蓋玻片放在 MatTek 培養(yǎng)皿中心的頂部。該組件在 60°C 的烘箱中聚合 2 天。
 

　　聚合后，通過鋸切靠近蓋玻片移除MatTek盤，并通過將組件浸入液氮和溫水中移除圓形中心和平兩側的玻璃。
 

　　使用刀片從樣品中切下一小塊，并使用雙組分銀導電環(huán)氧樹脂(Ted Pella，#16043)安裝在 SEM 針(Micro to Nano Gatan 3View 針，#10-006003-50)上。樣品的側面還覆蓋有銀環(huán)氧樹脂，最后使用 Q150RS 型 Quorum 濺射鍍膜機在 30 mA 電流下濺鍍一層金，持續(xù) 180 秒。為了固化銀環(huán)氧樹脂，樣品在 60 °C 下總共固化了一天。
 

　　圖像采集在帶有 Gatan 3View 的 Zeiss GeminiSEM 450 上進行(DigitalMicrograph 版本 3.51.3720.0；SmartSEM 版本 6.06，帶有 Service Pack 4)，安裝了用于控制采集的程序 SBEM Image (2021.08.dev) 91。對于圖像采集，使用 1.5 kV 的加速電壓、300 pA 的束流、10 nm 的像素尺寸和 1.6 µs 的停留時間。使用點 BSE 檢測器進行檢測，對比度設置為 99.9%，亮度設置為 11.8(帶倒置 LUT)，BSD 偏置為 -5 V。切片厚度設置為 40 nm。在每個周期之間，以 165.76 nm 像素大小和 0.8 µs 停留時間采集概覽圖像。
 

　　統計分析
 

　　使用 R(版本 3.2.1)進行統計分析，同時使用 R 和 Adob??e Illustrator® 進行數據可視化。數據分布的正態(tài)性通過Shapiro-Wilk檢驗進行檢驗。雙尾t檢驗用于正態(tài)分布。否則，如果沒有不同說明，則使用非參數 Mann–Whitney- U檢驗。在所有箱線圖中，下鉸鏈和上鉸鏈對應于第一和第三四分位數(第 25 個和第 75 個百分位數)。上須線從鉸鏈延伸到最大值，但不超過 1.5*IQR(第一四分位數和第三四分位數之間的距離)。下部須線從鉸鏈延伸至最小值，但不低于鉸鏈的 1.5*IQR。晶須末端以外的數據繪制為黑點。黑線和點分別對應于中位數和平均值。所有測量均取自不同的樣品。